于休烈，河南人氏。高祖于志宁，贞观年间任左仆射，为十八学士之一。父于默成，任沛县令，早逝。于休烈天性忠诚，机警聪慧。自幼好学，善做文章，与会稽贺朝、万齐融及延陵包融为文词朋友，一时都很著名。应举进士，又应制策考试登科，授秘书省正字之职。屡次升迁至右补阙、起居郎、集贤殿学士，调任比部员外郎、郎中。杨国忠任宰相时，排挤不依附自己的人，于休烈被调出京师任中部郡太守。
时值安禄山叛乱，肃宗即位，于休烈自中部奔赴皇上行宫，被擢升拜给事中。又调任太常少卿，知礼仪事，兼修国史。肃宗自凤翔还京，振作精神，听纳谏议，曾对于休烈说道：“君主的一举一动必定记录，是杰出的史官。如果朕有过失，卿是否要记录？”于休烈回答道：“禹、汤能批评自己的过失，因此勃然兴盛。有德行的君主，不忘规劝己身过失，臣极力庆贺不已。”此时中原动荡颠覆，典章丧失殆尽，无史籍文献可供检寻。于休烈启奏道：“《国史》一百零六卷，《开元实录》四十七卷，《起居注》连同其他书籍三千六百八十二卷，一并收藏在兴庆宫史馆。京城被贼攻陷后，尽遭焚烧。而且《国史》、《实录》，皆圣朝重大典籍，编撰已久，如今并无刻本。伏望下诏御史台查勘史馆藏书之来源，令府县征收寻访。有人从别处收得《国史》、《实录》，如送交官府，重金收购并赏赐。若是史官收得，则赦免其渎职之罪。得一部者越级授给官位，得一卷者赏绢十匹。”数月之内，仅收得一两卷。前任编修史官工部侍郎韦述陷入贼中，滞留东京，到这时便将其家所藏《国史》一百一十三卷呈送官府。
肃宗因太常寺钟磬自隋代以来，所传送五音，有时不协调，乾元初年对于休烈说：“古时圣人创作演奏音乐，用以应合天地之和谐、阴阳之顺序，则人不夭折，物不疵疠。而金石丝竹，是演奏音乐的器具。近来亲自祀郊庙，每听悬乐演奏，皆觉宫商五音不全，有时钟磬之音失调。可尽将钟磬送来，朕当在宫内亲自校正。”太常寺集合乐工检验调试数日，审察了解乐器之差错，然后命人重新铸造磨刻。及至制作完毕，皇上临殿亲自试验敲击，皆合于五音，群臣称贺。
于休烈随即调任工部侍郎、修国史，进献《五代帝王论》，皇上甚为称赞。宰相李揆恃才自夸而嫉妒贤能，因于休烈修撰国史与自己平列，便嫉恨他，奏请他任国子祭酒，暂且留在史馆从事修撰以贬低他。于休烈安然自处，毫不介意。传统礼仪，改元之初年冬至，百官不在光顺门朝贺皇后，乾元元年(758)，张皇后要行接受百官朝贺之礼。于休烈奏道：“《周礼》有受封之男子朝拜人主、受封之妇人朝拜女君的规定。自显庆以来，则天皇后开始实行这一礼仪。当天，命妇又朝拜于光顺门，与百官混杂相处，极为失礼。”肃宗便下诏停止这次朝贺。
代宗即位，审察鉴定官员之优者，宰臣元载称赞于休烈，于是拜于休烈为右散骑常侍，仍旧兼修国史，随即又加授礼仪使，调任工部侍郎。又改任检校工部尚书，兼判太常卿事，正式拜工部尚书，接着又封东海郡公，加授金紫光禄大夫。在朝前后三十余年，历任清要之职，家中没有些微积蓄。为人恭俭温良仁慈，从未以喜怒形于颜色。而亲贤下士，提携后进，虽位崇年高，却无半点厌倦之意。一心沉浸于研习古代典籍，手不释卷，直至生命终结。大历七年(772)去世，年八十一。有文集十卷刊行于世。嗣子于益，次子于肃，相继任翰林学士。
当年春天，于休烈之妻韦氏去世。皇上因于休烈父子儒雅著称，特别降诏追赠韦氏为国夫人，下葬日派给仪仗鼓吹。及至听说于休烈去世，追思痛悼许久，褒奖追赠尚书左仆射，赐给助丧用绢百匹，布五十段，派遣谒者内常侍吴承倩去宅第宣旨慰问。儒者所受之恩宠，少有能与之相比的。于肃官至给事中。于肃之子名敖。